وسترن بلاتینگ

وسترن بلاتینگ

وسترن بلاتینگ یکی از روش‌های بلاتینگ است که برای تشخیص و آنالیز پروتئین‌ها استفاده می‌شود. وسترن بلاتینگ یک آزمایش تأییدکننده است و وجود نوعی پادتن علیه چند نوع پروتئین ویروسی را بررسی می‌کند. این روش در مقایسه با تست الیزا، اختصاصی‌تر است ولی از حساسیت کمتری برخوردار است و چون آزمایشی نسبتاً گران محسوب می‌شود، به عنوان اولین آزمایش انجام نمی‌گیرد و بیشتر در تأیید نتایج مثبت شده تست الیزا بکار می‌رود. تست وسترن بلات در همراهی با تست الیزا، بیش از ۹۹٪ مورد اطمینان خواهد بود. 

وسترن بلاتینگ که همچنین به ایمونوبلاتینگ یا پروتئین بلاتینگ شناخته شده است، یکی از تکنیک‌های کلیدی در زیست شناسی سلولی و مولکولی است و معمولاً برای شناسایی حضور پروتئین خاصی در مجموعه‌ای از پروتئین‌های سلولی بکار می‌رود. فرایند این تست، به سه فاکتور اساسی بستگی دارد:

۱-جداسازی کل پروتئین‌ها بر اساس اندازه با استفاده از الکتروفورز پروتئین در ژل

۲-انتقال کافی پروتئین‌های جداشده به یک بستر جامد

۳-شناسایی اختصاصی پروتئین هدف با آنتی‌بادی مناسب.

در وسترن بلاتینگ باندهای پروتئینی از ژل به غشایی ماننده نیتروسلولز که قابلیت اتصال و تثبیت پروتئین ها را دارد، منتقل می شوند. در عمل بلاتینگ مولکولهای پروتئین از زمینه ژل خارج می شوند و در سطح غشا در همان موقعیت قرار می گیرند. از این رو به سادگی و با مقدار کمتری از مواد میتوان به مطالعه آنها پرداخت، یا آنها را جدا نمود و مورد استفاده قرار داد. به منظور تشخیص پروتئین ها یا آنزیم های منتقل شده به غشا میتوان از لیگاندهای اختصاصی یا سوبستراهای مربوطه استفاده کرد. آنتی بادی ها از متداولترین موادی هستند که برای تشخیص اختصاصی پروتئین ها در غشا بکار می روند. از همین رو چنین روش هایی به ایمونوبلاتینگ معروفند.

زمانی که پروتئین مورد نظر شناسایی شد، به صورت یک باند بر روی غشاء قابل‌مشاهده می‌شود. تست وسترن بلاتینگ به سرعت می‌تواند صورت بگیرد.

غشاهای مورد استفاده در بلاتینگ:

در عمل بلاتینگ معمولا از غشاهای نیتروسلولزی و یا پلی وینیلیدن دی فلورید (PVDF) استفاده می کنند. این دو غشا ظرفیت خوبی در اتصال به پروتئین ها دارند. نیتروسلولز ارزان تر است ولی ظرفیت مکانیکی کمی دارد و شکننده می باشد. اندازه منافذ نیتروسلولز بین 05/0 تا 45/0 میکرون متغیر می باشند. هرچه اندازه منافذ یک غشا کوچک تر باشد سطح مخصوص و ظرفیت اتصال آن بیشتر خواهد بود. دی آزو بنزیل اکسی متیل (DBM) ، دی آزو فنیل تیواتر (DPT) و نایلون از دیگر غشاهایی هستند که در موارد خاصی از عمل بلاتینگ بکار می روند. غشاهای نایلونی از ظرفیت و توان مکانیکی بالایی برخوردارند، اما بر خلاف سایر غشاها بار مثبت دارند. از این رو اغلب رنگ های آنیونی که برای پروتئین مورد استفاده قرار میگیرند، به آنها متصل میشوند. در مواردی که جداسازی پروتئین خاصی از غشا مورد نظر باشد، استفاده از غشاهای تعویض یون برای بلاتینگ مناسب می باشد. برای این کار قسمتی از غشا که حوای پروتئین مورد نظر است ، جدا می شود. سپس با قرار دادن قسمت جدا شده در بافر با PH یا قدرت یونی متفاوت ، پروتئین آزاد می شود.

مواد لازم جهت انجام تکنیک ایمونوبلات:

  1. غشای نیتروسلولز با اندازه منافذ 45/0 میکرومتر یا غشای ایموبیلون  (PVDF)

۲- بافر انتقال حاوی تریس 25 میلی مولار، گلیسین 192 میلی مولار و متانول 15 درصد 

مراحل وسترن بلاتینگ:

۱- جداسازی پروتئین روی ژل SDS_PAGE

۲- انتقال پروتئین از ژل به غشا

۳- Blocking  غشا

۴- افزودن آنتی بادی اولیه

۵- افزودن آنتی بادی ثانویه 

۶- آشکارسازی

کاربرد های دیگر وسترن بلات در تحقیقات علمی عبارتند از:

۱-تولید و بررسی خصوصیات آنتی بادی ها: 

با استفاده از وسترن بلات می توان اختصاصی بودن آنتی بادی تولید شده را بررسی کرد .

۲-بررسی تغییرات پس از ترجمه: 

با استفاده از آنتی بادی اختصاصی مربوط به اسید آمینه های فسفریله شده و یا سایر تغییرات پس ترجمه ای می توان وضعیت پروتئین های تغییر شکل یافته را تعیین کرد.

۳-تعیین موقعیت درون سلولی یک پروتئین: 

پس از جدا کردن ارگانل های سلولی از یکدیگر با کمک وسترن بلات بیان پروتئین مورد نظر در هر یک از ارگانل ها بررسی می شود.

۴-نقشه یابی اپی توپ ها: 

نقشه یابی اپی توپ ها شامل تعیین جایگاه های اتصال (اپی توپ ها) آنتی بادی ها روی پروتئین ها می باشد. شناسایی این اپی توپ ها در طراحی و تولید داروها، واکسن ها و همچنین در تشخیص کاربرد زیادی دارد.

۵-توالی یابی پروتئین ها و پپتیدها: 

پروتئین ها پس از انتقال به غشای  PVDF به راحتی جدا شده و با استفاده از اسپکترومتری جرمی تعیین توالی می شوند. این روش به خصوص برای تعیین توالی پروتئین هائی که غلظت کمی دارند  (10 pmol) کاربرد فراوانی دارد.

۶- برهمکنش های پروتئین-پروتئین: 

وسترن بلات مرحله نهایی در  co-immunoprecipitation (Co-IP) است. Co-IP یکی از روش های مهم در تأیید برهم کنش بین دو پروتئین مورد نظر می باشد. در این روش بعد از ایمنو پرسیپیتاسیون با استفاده از وسترن بلات برهم کنش های دو پروتئین مورد بررسی قرار می گیرد.